jueves, 25 de octubre de 2012

MEJORANDO PRODUCCIÓN DE COLORANTES con métodos de biotecnologías


Cloning, sequence analysis, expression of Cyathus bulleri laccase in Pichia pastoris and characterization of recombinant laccase
autores: Neha Garg, Nora Bieler, Tenzin Kenzom, Meenu Chhabra, Marion Ansorge-Schumacher and Saroj Mishra
BMC Biotechnology 2012, 12:75 doi:10.1186/1472-6750-12-75

Fondo
Las lacasas son azules de cobre multi-oxidasas y catalizar la oxidación de compuestos fenólicos y no-fenólicos. Existe un considerable interés en el uso de estas enzimas para la degradación de colorante, así como para la síntesis de compuestos aromáticos. Las lacasas son producidas a niveles relativamente bajos y, a veces, como isoenzimas en los hongos nativos. La investigación de las propiedades de las enzimas individuales por lo tanto se hace difícil. El objetivo de este estudio fue producir en exceso una lacasa se informó anteriormente de Cyathus bulleri utilizando el sistema de expresión bien establecida de Pichia pastoris y examinar y comparar las propiedades de la enzima recombinante con el de la lacasa nativa.
Resultados
En este estudio, lacasa completa ADNc que codifica (Lac) de podredumbre blanca hongo Cyathus bulleri se amplificó por RACE-PCR, clonado y expresado en el sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris bajo el control de la alcohol oxidasa (AOX) 1 promotor. La región de codificación consistía en 1.542 pb y codifica una proteína de 513 aminoácidos con un péptido señal de 16 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína madura muestra una alta homología con las lacasas de Trametes versicolor y Coprinus cinereus. El análisis de la secuencia indicó la presencia de Glu 460 y Ser 113 y tripéptido LEL en la posición sabe que influyen en el potencial redox de las lacasas la puesta de esta enzima como una enzima redox alta. La adición de sulfato de cobre al medio de producción mejorado el nivel de lacasa con aproximadamente 12-veces a una actividad final de 7200 U L-1. La lacasa recombinante (RLAC) se purificó por ~ 4-veces a una actividad específica de ~ 85 U mg proteína-1. Un estudio detallado de la termoestabilidad, cloruro y la tolerancia de disolvente de la RLAC indicaron mejora en las dos primeras propiedades en comparación con la lacasa nativa (NLAC). Patrón de glicosilación alterado, identificado por impresión péptido dedo masa, fue propuesta para contribuir a las propiedades alteradas de la RLAC.
Conclusión
Lacasa de C. bulleri fue producido con éxito extracelularmente a un alto nivel de 7200 U L-1 en P. pastoris bajo el control del promotor de AOX1 y se purificó mediante un simple procedimiento de tres pasos a homogeneidad. Los parámetros cinéticos contra ABTS, guayacol y pirogalol fueron similares con la NLAC y la RLAC. Tríptico análisis de huellas dactilares de la NLAC RLAC y la alteración de los patrones de glicosilación indicado. Aumento de la tolerancia termo-estabilidad y la sal de la RLAC se atribuyó a este patrón cambió de glicosilación.
ver mas en:
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/12/75/abstract
tomado de envío de BCM


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